Choix des animaux
Les médakas ont été gracieusement fournis par le Dr. M. EDERY, directeur de recherche détaché de l' INSERM, chercheur à l' USM 505 « Ecosystèmes et interactions toxiques » du Muséum National d' Histoire Naturelle, responsable de l' animalerie médaka de cette unité.
Il fut choisi de prélever des animaux de deux mois, car à cet âge, les poissons sont encore de petite taille, ce qui permet d' obtenir un animal entier en coupe longitudinale sur une lame, et matures sexuellement.
Huit individus ont été choisis en fonction des caractères sexuels secondaires de ces poissons, de manière à utiliser pour l' atlas deux mâles et deux femelles, les autres animaux étant gardés en réserve en cas d' erreur sur l' identification des sexes.
Anesthésie et fixation
Les animaux prélevés ont été anesthésiés dans l' eau glacée pendant quelques minutes puis ont été placés pour 48h dans un grand volume (1/20 de leur taille) de liquide de Bouin froid à 4°C, la queue ayant été préalablement coupée au scalpel pour permettre une meilleure pénétration du fixateur.
Le liquide de Bouin a été choisi comme fixateur car il permet de ramollir les structures osseuses et donc évite une étape de décalcification. Le liquide est préparé extemporanément à partir d' une solution acide picrique saturée (75% du volume), d' acide acétique (5% du volume), et de formaldéhyde tamponné 4% Carlo Erba ® ref. 415691 (37% du volume).
Inclusion, réalisation des coupes
L'inclusion en paraffine suit trois étapes :
- une déshydratation des échantillons
- une imprégnation dans la paraffine liquide
- la constitution de blocs pour la coupe
Les échantillons sont d' abord déshydratés dans des bains d' alcool et de butanol. A 48h, ils sont sortis du fixateur et rincés rapidement dans de l' eau puis subissent 2 à 3 bains de quelques minutes dans de l' éthanol à 50°. Ils sont ensuite placés pour deux jours dans l' éthanol 70° à 4°C avec changement du bain d' alcool deux à trois fois par jour jusqu' à ce que les échantillons aient perdu la couleur jaune induite par le liquide de Bouin. Ils sont ensuite placés dans l' éthanol 90° pendant 24h à 4°C puis sont transférés dans le butanol à 4°C où ils sont stockés jusqu' à inclusion.
Les poissons sont ensuite individuellement mis en cassette, qui sont plongées dans de la paraffine liquide à 56°C pour inclusion.
La méthode d' inclusion manuelle dans des bains de paraffine à 56°C changés quotidiennement pendant une semaine a été préférée aux techniques d' inclusion sous vide plus rapides mais pouvant endommager les tissus des poissons.
Enfin, après une semaine d' inclusion, les poissons sont mis en bloc. Pour les coupes longitudinales, les animaux sont placés sur le flanc au fond de la cassette. Pour les coupes transversales, ils sont coupés par une section transversale au scalpel en arrière des branchies. Les deux faces obtenues sous disposées de manière à être exposées à la surface du bloc. Les blocs sont placés au froid et conservés à 4°C.
Des coupes de 3,5 µm sont réalisées sur un microtome Leica ® RM2245 à partir des blocs refroidis sur une plaque à -7°C. Les coupes sont étalées sur des lames superfrost ® grâce à un bain marie à 37°C contenant 5ml de colle Stick On ® Labonord. (fgure ci-contre).
Tous les 100 µm, trois coupes transversales et deux longitudinales consécutives sont récupérées sur une lame.
Photo
Les photos des coupes longitudinales
et transversales ont été prises grâce à un
microscope Leica DMR couplé à une caméra numérique
raccordée à un ordinateur de type PC équipé
du système logiciel TRIBVN®.
Dix-neuf photos de coupes longitudinales et 43 photos de coupes transversales
de quatre blocs ont été prises à l’objectif
1,5, zoom 0,5. Dix-sept gros plans d’organes ont été
pris à l’objectif 2,5 et au zoom 2,5 ou 1,6. Certaines
coupes longitudinales dépassaient le champ de l’appareil
photo ; elles ont donc été prises en deux fois.
Le format numérique d’acquisition des photos est le format
jpeg.
Coloration
Après séchage en étuve à
37°C pendant au moins deux heures, les lames sont colorées
par l’HES (Hématoxyline-Eosine-Safran), coloration standard
utilisée en histologie. L’hématoxyline colore les
noyaux en violet, l’éosine colore le cytoplasme en rose et
le safran teint en jaune les fibres de collagène.
Cette coloration a été effectuée soit à l’aide
d’un automate Leica® CV5030/ST5020, soit manuellement, selon
le protocole suivant :
- 3 bains de toluène de 15 minutes
- 2 bains d’alcool 100° d’une minute
- 1 bain d’alcool 95° d’une minute
- rinçage dans 4 bains d’eau du robinet
- 1 bain d’hématoxyline de 2 minutes
- 4 bains d’eau distillée
- passage dans un bain d’acide chlorhydrique (HCl) aqueux à
2%
- rinçage à l’eau
- 1 bain d’éosine d’une minute
- 4 bains de rinçages à l’eau
- passage dans un bain d’alcool 100°
- 1 bain de safran (5minutes)
- passage dans 2 bains d’alcool 100°
- 3 bains de toluène de 2 minutes
- montage des lames en Eukitt®